Röntgenstrahlen entstehen, wenn schnelle Elektronen auf einen festen Körper (Target) auftreffen und dort schlagartig abgebremst werden.
In einer Mikrofocus-Röntgenröhre werden daher zunächst Elektronen durch Glühemission aus einem geheizten Wolframfilament (Heizspannung UH) ins Vakuum freigesetzt. Die Elektronen werden durch die Röhrenspannung UAcc zur Anode hin beschleunigt und erreichen dort etwa ein Drittel der Lichtgeschwindigkeit. Der Strom wird durch die Steuerelektrode (Gitter, Wehnelt-Zylinder) mit der Spannung UG reguliert. Nach dem Durchtritt durch die Anode wird der Strahl durch eine Anordnung von Ablenkmagneten auf die optische Achse einer magnetischen Elektronenlinse gesetzt, die den Strahl bündelt und auf die Targetoberfläche fokussiert.
Der Brennfleckdurchmesser gibt die Größe der Röntgenquelle vor; er beträgt einige Mikrometer. Das Transmissionstarget besteht aus einer dünnen Wolframschicht, die auf einem Träger aus Leichtmetall aufgebracht ist. Dieser Träger dient gleichzeitig als Austrittsfenster für die Strahlung.
Beim Transmissionstarget liegt die Röntgenquelle also sehr dicht an der Aussenwand der Röntgenröhre, so dass man die Proben sehr nahe an sie heranbringen und somit sehr hohe Vergrößerungen erzielen kann.